Paintings & Photography

On the Determination of Polyphenoloxidase-Activity in Potatoes

Description
The method of Voigt and Noske for the determination of polyphenoloxidase (PPO) was modified for analysis in potatoes by determining the pH-optimum with pH 5,8 in phosphate buffer and the temperature optimum with 22°C. The PPO was completely inhibited
Published
of 6
16
Published
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Share
Transcript
  211 bei sehr niedriger r.L. (z. B. bei 2 ) eine Hydrolyse beobaehtet werden. Sie wird in der Regel minimal sein. Ihr Umfang wird yore Antefl an flfissiger Phase in diesem Fett abh/~ngen und davon, wie eng tier Kontakt zwisehen Enzym mad Substrat dureh den Misehvorgang hergestellt worden ist. Es ist ffir die Lipolyse in einem wasserar- men Lebensmittel nieht gleiehgiiltig, in weleher Weise das Substrat zugegeben und verteilt worden ist. Bei h6herer r.L. k6nnen feste Triglyeeride hydrolysiert werden, wenngleich in einem wesentlieh geringeren Ausmal~ als fliissige. Literatur 1. Acker, L.: Z. Ern~brungswiss. Suppl. 8, 45 (1969). 2. -- Food Technol. 28, 27 (1970). 3. -- Huber, L. : Lebensmittel-Wiss. Technol. 2, 82 (1969). 4. -- -- Lebensmittel-Wiss. Technol. 3, 33 (1970). 5. --Beutler, H. O.: Fette, Seifen, Anstrichmittel 67, 430 (1965). 6. -- Fette, Seifen, Anstrichmittel 62, 906 (1960). 7. -- Kaiser, I-L: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 115, 201 (1961). 8. Purr,_A.: Fette, Seifen, Anstrichmittel 68, 145 (1966). 9. Acker, L., Wiese, R. :Lebensmittel-Wiss. Technol. (im Druck). 10. Wiese, R.: ~er die enzymatisehe Lipolyse in wasserarmem Milieu und ihre Abhtingigkeit yon ~ulleren Faktoren. Dissertation. Univ. Miinster/Westf. 1969. 11. Riedel, L.: Fette, Seifen, Anstrichmittel 57, 778 (1955). 12. Roozen, J.P., Pflnik, W. : Lebensmittel-Wiss. Technol. 4, 93 (1971). 13. Caillat, M.J.-M.: Contribution & l'6tude de la lipase du bl6: isolement, caract6ristiques de son action en milieux aqueux et peu hydrat6. Dissertation. Univ. Paris 1970. S. 60. Professor Dr. L. Acker Institut ffir Lebensmittelchemie der Universit~t Mfinster D-4400 Miinster Bundesrepublik Deutschland Zur Bestimmung der Polyphenoloxydaseaktivit it in Kartoffelknollen K~vs SC~ATL~ ~itteilung aus dem Institut iir Pflanzenern~hrung der Teclmischen Universit~t Miinchen in Weihenstephan (BRD) ingegangen am 14. August 1972. On the Determination of Polyphenoloxidase-Activity in Potatoes Summary The method of ¥oigt and Noske for the determination of polyphenoloxidase (PPO) was modified for analysis in potatoes by determining the pH-optimum with pH 5,8 in phosphate buffer and the temperature optimum with 22°C. The PPO was completely inhibited by 5.10 -~ tool cystein; the prepared aceton-dried samples can be preserved in the exsiceator for 3 weeks without any loss of activity. Zusamqnen/assung Die yon Voigt u./qoske [8, 9] besehriebene Methode zur Bestimmung der Phenoloxydase-Aktivit~t (PPO) wurde ffir Kartoffelknollen modlfizier~. Hierzu wurden das pH- Optimum mit pH 5.8 in Phosphatpuffer naeh McIlvain sowie das Temperaturoptimum mit 22°C ermittelt. Dutch 5 • 10 -~ tool Cystein wurde eine totale Hemmtmg der PPO festgestellt. Die hergestelltcn Acetontroekenpr~parate sind 3 Woehen im Exsiecator bei unver/~nderter Aktivit~t haltbar. inleitung Die Polyphenoloxydase (PPO) benutzt als Substr~t o-Diphenole (z. B. Kaffees/iure) and Polyphenole (z. B. Chlorogens/~ure), die zu den entsprechenden o-Chinonen oxydiert werden unter gleiehzeitiger Hydroxylierung yon Monophenolen.  2 2 In der Lebensmitteltechnologie ist sie yon Bedeutung im Hinbliek auf die sogenannte Roh- dunkelung bei der Verarbeitung pflanzlieher Produkte, im Bereieh der PhyChopathologie wird sie als Teil eines Abwehrmechanismus der Pflanze gegen Parasiten diskutiert. In einer Vielzahl yon Methoden [1] wird die titrimetrisehe Bestimmung der PPO-Aktivitit sehr h~ufig angeweudet. Dem Enzymansatz wird eine bestimmte Menge Aseorbins~ure zur Re- duktion der gebfldeten Chinone zugesetzt mid naeh dem Abstoppen der Reaktion mit iKetaphos- phors~iure der nicht verbrauehte Rest zuriiektitriert. Reaktionsablauf: o-Diphenol -t- 1/202 PPO o-Chinon q- H~O o-Chinon q- Ascorbins~iure o-Diphenol q- Dehydroaseorbinsiure Diese Bestimmung birgt FehlermSglichkeiten in sieh, insbesondere bei Vorliegen gefirbter Pflanzenextrakte ((sehleehter Umsehlagspunkt ). Im gleichen MaBe anf~llig sind aueh spektrophotometrisehe Methoden, bei denen die Abnahme des zugesetzten Substrat~s bzw. die Zunahme des gebildeten Produktes im Absorptionsmaximum gemessen wird [4]. Hier wirkt sieh besonders naehteilig aus, dab die gebildeten o-Chinone starke Inhibitoren sind und die Enzymreaktionen selmell zum Stillstand bringen. Methodik Nach Abw~gung aller in den oben genannten 1VIethoden auftre~enden FehlermSg- lichkeiten haben wit uns ffir die yon Voigt u. Noske [8, 9] entwickelte Arbeitsweise entschieden: Das Prinzip der Methode beruht darauf, dab das gebfldete o-Chinon mit 3-Methylbenzthiazolinon-2-hydrazon (Besthorn's Reagens) gekoppelt wird und aus dem Testansatz in eine unterschichtete Chloroform-Phase fiberffihrt wird; die Enzymreaktion wird auf diese Weise durch die entstehenden Reaktionsprodukte nicht gehemmt. Da die yon Voigt u. Noske [8, 9] beschriebene Methode nur ffir Apfelhomogenate ausgearbeitet wurde, w~r ihre Brauchbarkeit fiir Kartoffelpr~pa- rate noch zu priifen. 1 Herstellung des Acetontrockenpr?i~garates 20 g gewfiffelte Kar~offeln (Mischprobe) in ein weites Reagensglas (~ 3 cm, HShe 20 era) ein- wiegen, mit 40 nil Aeeton yon --18°C iibergieBen und im ,,Ultra Turrax" (Typ 18/2, Janke & Kunkel, Staufen/Br.) 30 sec misehen. Den erhaltenen Brei auf einer ausgewogenen Glasfflter- nutsehe (Schott 15 G3) zehnmal mit jeweils 10 ml Aceton durehspiilen, zuniehst ohne Unterdruek. Gegen Ende des Spiilvorgangs mit einer Wasserstrahlpumpe ein Vakuum anlegen und damit den grSl~ten Teil des Acetons entfernen. Den Rest im Vakuumexsieeator (nach ca. 3/4 Std) entfernen. Die Glasfilternutsche mit dem Pr~parat auswiegen und dureh Subtraktion der Tara das je 20 g Frisehmasse gewonnene Trockenpriparat ermitteln. Dieses in einer Reibsehale zu einem troekenen, feinen Pulver verreiben. Hierdurch wird erreicht, dab keine Entmischung im Troekenpriparat mehr stattfindet mid mit einer guten Durehsehnittsprobe weitergearbeitet werden kann. 2 Enzymaktlvitgt 10 ml SubstratlSsung (50 mg Brenzcatechin, Merck pro anal in Phosphatpuffer nach ~eIlvain) in einer Waschflasehe mit Fritteneinsatz mit 10 mg Enzymtrockenpr~parat, 60 nil Chloroform und 1 nil Besthorn's Reagens (1%ige LSsung des Hydrazons in Methanol) versetzen. Dann 20 min lang Luft (1501/Std) dutch den Ansatz leiten, die Chloroformschicht abtrermen, die w~l~rige Phase noch einmal mit Chloroform aussehiitteln und die vereinigte organische Phase auf ein bestimmtes ¥olumen (z. B. 80 nil) erg~nzen. Die Intensitit der entstandenen Rotf~rbung im Spektralphoto- meter bei 500 nan (Abb. 1) in 1-cm-Kiivetten messen. Als Blindwert dient eine Vergleichsprobe ohne Substrat. Zur Bereehnung der Enzymaktivit~t wurde die yon Voigt u. Noske [8, 9] vorgesehlagene 1%rmel iibernommen: Ti PPO-Aktivitit ~- E × T--~ Dabei ist: E = Extinktion der Chloroform-Phase bei 500 nm in 1-cm-Kiivetten; T1 mg Trockenpri~parat, das aus 20 g Frisehmaterial gewonnen wird; T2 = mg Troekenpraparat, das fiir den Ermymansatz verwendet wird. LVaeh-dieser Bereehnung wird also die Enzymaktivitit auf den Troekensubstanzgehalt der Probe bezogen. Diese BezugsgrSl~e ist nicht ganz korrekt, exakter w~re der Proteingehalt. Sie wurde aber trotzdem beibehalten, da dis Methode in dieser Form besser fiir groBe Serienbestim- mungen geeignet ist.  213 AE 1 0 0 8 0 6 0 2 ~ 200 2 ~0 278 310 ~00 500 nm Abb. l. Absorptionsspektrum der entstehenden Rot~rbung; gemessen im Zeiss-Spektralfoto- meter 1)~ QII 3. Methodische Vorversuche Die yon Voig~ u. Noske [8, 9] gefundene Abhi~ngigkeit der entstehenden Rotf&r- bung yon Enzymmenge, Luftdurchflul~geschwindigkeit un4 Reaktionsdauer konnte best~tigt werden. Da die Autoren jedoeh keine Angaben fiber die Incubationstempe- ratur gemacht haben und das pH-O10timum der Kartoffelphenolase nicht bekannt war, muBten entspreehende Daten erarbeitet werden. pH-Optimum: Die Enzymaktivit~t wurde wie unter 1. besehrieben in Phosphat- puffer naeh MeIlvain im Bereieh yon pH 3,0-8,6 gemessen (Abb. 2). 0 1 3 ~ 5 6 7 8 9 pH Wert Abb. 2. pH-Optimum der 1)1)O 1.5 v ~_ Die PPO hat also ein sehr schaff definiertes Optimum bei pH 5,8. Im alkalischen Bereieh ist der Abfall nicht so stark wie im sauren, wo die AktivitKt bei pH 3,0 schon fast Null ist. Der yon Voigt u. Noske [8, 9] empfoMene pH-Wer~ yon 6,0 ffir Apfel- trockenpri~parate wfirde auf Kartoffelpr~parate fibertragen gegenfiber dem yon uns ermittelSen Optimum zu einem Aktivit~tsverlus~ yon 8 % ffihren. Temperatur Optimum. Bei der unter 1. beschriebenen Arbeitsweise kommt es, bedingt dutch das t/indurchleiten der Luf$ dt~rch den Reaktionsansatz, zu einem Verdampfen des Chloroforms and somit zu einer Ab- kiihlung des gesamten Enzymansabzes. Da in der zitierten Arbeit keine genaue Temperatur ange- geben ist, ermittelten wir ffir unsere Bedingungen das Temperaturoptimum. Hierzu wurden die Waschflaschen in einen ,,Ultrathermostaten (~Ie0gerg~werk Lauda) bzw. Kryomaten (Typ KD 50, MeBgeri~tewerk Lauda) gestellt und durch die Ansi~tze vorgew~rmte bzw. gekiihlte Luft durchgeleitet.  214 Aus Abb. 3 wird ersiehtlieh, da~ die PPO unter dem gegebenen Versuchsbedin- gungen ein Optimum bei 22°C besitzt; die Bestimmungen mfissen also in einem Thermostaten durchgeffihrt werden. Erstaunlieh ist allerdings, dab im Bereich tieferer Temperaturen (0 bis-12°C) noeh eine verh~ltnismi~6ig hohe Aktiviti~t vorhanden ist (bei --12°C sind erst 52 % der urspriingliehen Aktivitgt verloren gegangen). t,5 o: ~1,0 0.1 \// ; L , I I,, ,1 ~ ~ 10 0 10 20 22 30 0 3 Abb. 3. Temperaturol)timum der PPO Die in Abb. 3 gestriehelt eingezogene Linie k6nnte zu der Vermutung AnlaB geben, daft das Enzym zwei Temperaturoptima besitzt. Dies kSnnte durch die Untersuehun- gen yon Marerae u. Duggleby [3] erh~rtet werden, die flit die Phenoloxydase zwei aktive Zentren postulieren. Diese Ergebnisse bestiitigen damit die Befunde yon Kiermeier [2], wonaeh be- stimmte Enzyme in pflanzliehem bzw. tierischem Material sowie in Mikroorganismen trotz tiefer Temperaturen noeh teilweise aktiv bleiben kSnnen. Dieses Verhalten der PPO kann dazu beitragen, das Nachdunkeln ,,vorfritierter t)ommes frites zu erklg- ren, die wi~hrend des Einfrierens - sofern keine Schoekgefrierung vorgenommen wird - meistens einen sogenannten ,,~ot- oder Blaustich bekommen [6]. ttemmung der Aktivititt: Es ist bekannt, dab z. B. Ascorbins~ure als Inhibitor der PPO im Bereich yon 4.10 -5 tool wirken kann [7]. In den folgenden Versuehen wurde die ttemmwirkung des Cysteins auf Kartoffel-PPO geprfift. Zu diesem Zwecke wurden Reaktionsans~tze mit steigenden Mengen Cystein versetzt und nach dem Abstoppen der Reaktion die Extinktion der organisehen Phase gemessen (Tab. 1). Tabelle 1. Wirkung steigender Cysteinmengen auf die t)PO-Aktivit~t Cysteinzugabe Aktivit~t in % in 10 5 tool der Kontrolle 0,1 112 0,5 103 0,8 94 1 71 2 62 5 34 8 27 10 9 50 0 Im Bereich yon 1 10 -6 bis 5.10 -6 tool Cystein tritt eine leichte Stimulation der PPO-Aktivit&t ein, eine weitere Steigerung der Cysteinkonzentration ffihrt jedoeh zu einem Abtall yon 6 bis schlieBlieh 100 %.  215 Tabelle 2. Aufhebung der durch 5  10 4 tool Cystein bewirkSen Hemmung der PPO mittels PCMB PCM_B-Zusatz Aktivit~it in % in 10 -~ tool der Kontrolle 0 0 39 2 46 3 48 5 51 Wenn man dem Ansatz aber entsprechende Mengen an p-Chlormereuribenzoat (PCMB) zusetzt, kann ein Tell der Enzymaktivit/~t zuriiekgewonnen werden (Tab. 2). Eine Hemmtmg der PPO dutch PCMB allein konnte dagegen nieht beobaehtet werden, damit ist indirekt bewiesen, dal3 dieses Enzym keine aktiven SH-Gruppen besitz~, sondern ein Sehwermetallproteid darstell~. Dutch Zusatz eines ,,SH-Gruppen- blockers karm die durch 5  10 -a tool Cystein bewirkte totale Hemmung der PPO zu rund 50 % wieder aufgehoben werden. Haltbarkeit des Aeetontrockenpr~parates. Acetontroekenpr/~parate zur Bestim- mung der Kartoffel-PPO haben naeh Weaver u. Hautala [10] eine Haltbarkeit yon mehr als einem Jahr. Unsere Versuehe ergaben aber, da$ eine unver/inderte Aktivit/it nur fiber einen Zeitraum yon 3 Woehen gegeben ist (Tab. 3). Tabelle 3. Aktivit~t der PPO in Acetontrockenpr/~paraten bei verschiedener Lagerzeit Lagerzeit Aktivit~tt Aktivit~ttsverlust in Wochen der PPO gegeniiber Zeitpkt. 0in% 0 0.926 -- 1 0.926 3 0.926 -- 4 0.835 10 5 0.702 24 6 0.474 50 •aeh 6 Woehen ist bereits ein Verlust yon 50 % eingetreten. Die Troekenpr/ipa- rate wurden im abgedunkeltem und evaksiertem Exsiceator aufbewahrt. 4. Endgiiltige Arbeitxweise zur Bestimmung der PoZyphenoloxydase Aktivlt~it Die l:ierstellung des Acetontrockenpriiparates erfolgt wie untcr 1. beschrieben; die Pr~parate werden im Vakuumexsiccator aufbewahrt und innerhalb 3 Wochen verarbeitet. 10 ml SubstratlSsung (50 mg Brenzcatechin, Merck pro anal. Phosphatpuffer nach McIlvain p//5,8) in einer Wasckfiasche mit 10 mg Enzymtrockenpr~parat, 60 ml Chloroform und 1 ml :Besthorn's :Reagens (1%ige LSsung des tIydrazons in Methanol) versetzen. Die Waschflaschen in einen Thermostaten bei 22°C bringen (Ultra Thermostat, Mel]ger~tewerk Lauda), sodann 20 rain lang Luft hindm'chleiten (1501/Std) und weiter verfahren wie unter 1. beschrieben. Diskussion Bet vorliegenden ,,endgiiltigen Arbeitsweise zur Bestimmung der Ak~ivit~t der Phenoloxydase in Kartoffelknollen halter eine gewisse FehlermSglichkeit an, da die Enzymaktivit~ten auf Trockensubstanz bezogen werden und nicht wie gew6hnlich auf Protein im Enzymansatz. Wie aber an anderer Stelle nachgewiesen werden konnte [5], sind die Schwankungen der Trockensubstanzgehalte yon Kartoffein wiihrend der Lagerperiode sehr gering (1-2 %). Die Aktiviti~ten der Polyphenoloxydase nehmen aber z. T. bis zu 200 % ab, so dab diese Fehlerquelle im Rahmen unserer Arbeiten als gering erachtet werden kann. Unter Berficksichtigung dieses Mangels ist die Me- rhode sehr gut ~fir Routineanalysen und vergleichende Untersuchungen geeignet.
Search
Tags
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks
SAVE OUR EARTH

We need your sign to support Project to invent "SMART AND CONTROLLABLE REFLECTIVE BALLOONS" to cover the Sun and Save Our Earth.

More details...

Sign Now!

We are very appreciated for your Prompt Action!

x