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Carolina Reyes Batista EFEITOS DA DUPLA TRANSGENIA DO EIXO SOMATOTRÓPICO (GH/GHR) SOBRE ASPECTOS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FURG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ICB PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS: FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA Carolina Reyes Batista EFEITOS DA DUPLA TRANSGENIA DO EIXO SOMATOTRÓPICO (GH/GHR) SOBRE ASPECTOS ESTRUTURAIS E MOLECULARES DO SISTEMA IMUNOLÓGICO DO PEIXE- ZEBRA (Danio rerio) Rio Grande 2014 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FURG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ICB PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS: FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA Carolina Reyes Batista EFEITOS DA DUPLA TRANSGENIA DO EIXO SOMATOTRÓPICO (GH/GHR) SOBRE ASPECTOS ESTRUTURAIS E MOLECULARES DO SISTEMA IMUNOLÓGICO DO PEIXE- ZEBRA (Danio rerio) Dissertação de mestrado a ser defendida no âmbito do Programa de Pós- Graduação em Ciências Fisiológicas- Fisiologia Animal Comparada como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE. Orientador: Luis Fernando Marins Co- orientador: Márcio de Azevedo Figueiredo Rio Grande 2014 II Every great advance in science has issued from a new audacity of imagination. John Dewey, The Quest for Certainty, 1929 III AGRADECIMENTOS Se fecha mais uma etapa da minha formação acadêmica. Quando iniciei no tão desejado mestrado em Ciências Fisiológicas não tinha ideia de quantos desafios, aprendizados e crescimento que essa etapa me traria. Hoje é com emoção que escrevo estes agradecimentos. Em primeiro lugar, agradeço ao meu orientador Dr. Luis Fernando Marins que me abriu as portas do laboratório de Biologia Molecular a seis anos atrás. Foram durante as aulas de bioquímica na graduação que a admiração começou: - Quando crescer quero ser que nem ele!. Obrigada por me permitir conviver de perto com teu exemplo profissional e participar da tua equipe. Tuas ideologias e mentoria sempre me estimularam a dar o melhor de mim e não ter medo de alçar voos mais altos. Ao meu querido co- orientador Dr. Márcio Figueiredo que me aceitou como co- orientada. Agradeço pela convivência, por me ajudar a tanto tempo e com tanta paciência. Tua perspicácia e inteligência contribuíram fundamentalmente para meu crescimento. Obrigada por todas as orientações não científicas também, que sempre vieram desse coração enorme. Agradeço muito ao Prof. Dr. Luis Alberto Romano e a Dra. Elsa Haas do Departamento de Patologia do Hospital Pamenio Pineiro, Buenos Aires, Argentina. Sem o auxílio de vocês as análises histológicas e imunohistoquímicas não seriam possíveis. Obrigada ao Prof. Romano pela atenção e disponibilidade, por contribuir na minha formação como um todo. Agradeço também a Marta Klosterhoff, que me auxiliou no emblocamento do material para as análises. Foi um privilégio contar com vocês! Aos professores que aceitaram o convite de participar da banca: Prof. Dr. Luiz Eduardo Maia Nery e Prof. Dr. Vinícius Farias Campos. As contribuições de vocês serão muito bem- vindas para o aprimoramento deste trabalho. Agradeço aqueles sem os quais eu não estaria aqui. Aos meus pais Norma e Jorge Batista que me deram a dádiva da vida, me educaram e estimularam. Obrigada por acreditarem em mim independente das circunstâncias. É essa fé que vocês tem em mim que me faz forte para seguir em busca. Agradeço também a minha amada vozinha Alva que não entende muito bem se eu estudo ou trabalho na FURG, realmente é confuso né?! Eu amo vocês! Ao meu amor, Gustavo Parfitt que caminha ao meu lado na vida e na ciência. Por acreditar em mim e ter me dado forças quando as minhas se acabavam. Por me estender a mão sempre que eu preciso. Obrigada pelo amor, carinho, dedicação e companheirismo. Pela paciência nesses últimos dias pré- defesa. Juntos enfrentaremos muitos desafios mas estaremos seguros porque temos um ao outro. Eu te amo! As minhas queridas amigas Maiara Marques e Carolina Peixoto que compartilham comigo inúmeros desafios da vida científica e não científica desde a graduação. Com vocês tenho aprendido a ser uma pessoa melhor. Obrigada pela amizade, por serem pontinhos de luz e leveza da minha vida. O carinho, os sorrisos e os abraços de vocês me fazem ser muito feliz. Amo vocês! IV Agradeço ao carinho de um casal de amigos fofos: Bruno Cruz e Cristiane Bolico. Obrigada por fazerem eu desopilar muitas vezes e por me proporcionarem momentos de (no mínimo) alegria e descontração! Adoro vocês! A minha querida amiga Marina Giacomin, que compartilhou tantos momentos maravilhosos (e outros nem tanto) durante o mestrado. São muitas histórias! Sinto muito tua falta mas entendo, a vida é boa mesmo aí no Canadá! Tu mora dentro do meu coração! Ao meu amigo Bruno Oliveira, que sempre admirei pela inteligência e interesse científico, desde a graduação. Com o passar dos anos, a admiração e a afinidade só aumentaram e se estenderam tornando tu uma pessoa essencial na minha vida. Obrigada pela amizade incondicional e por estar sempre perto! Aos meus amigos da sala quatro e do laboratório de Biologia Molecular que dividem o convívio diário comigo e enfrentam minhas oscilações de humor, são eles: Márcio, Dani (+ Joana), Lupe, Liane, Fred, Renatão, Rubens, Isabel, Cássia, Bruno Cruz, Bruno Oliveira, Camila Dalmolin, Cássia, Natália e Raiza. Obrigada pelo companheirismo, pelas conversas, cafés e momentos de descontração. A companhia de vocês torna o dia- a- dia mais leve! Agradeço especialmente a Bruna por ter me acolhido no laboratório logo no início e as queridas Cecília e Juliana por todo carinho e amor que permitiram que nossa amizade crescesse ainda mais! Adoro vocês! A todos meus colegas da Fisiologia que compartilharam momentos de estresse, seminários e provas, somados a experimentos e mais experimentos. Aos que tornaram a vida mais leve seja com piadas ou com tragédias engraçadas: Roberta Socoowski, Gisele Weber e Lidiane Dal Bosco. Ao pessoal da casa mais badalada do Cassino também: Alexandre Hartmann, Aline Sartório e Danusa Leidens. Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande FURG pela oportunidade de realizar minha formação acadêmica em uma instituição pública de excelência; Agradeço ao Programa de Ciências Fisiológicas: Fisiologia Animal Comparada e a seus professores que contribuíram imensamente para a minha formação. Obrigada pela paciência e dedicação; As agências de fomento Capes e CNPq pelo apoio financeiro durante o mestrado. E por fim agradeço aqui, mesmo que simbolicamente, a todos mistérios que ainda permanecem escondidos nessa imensidão de fenômenos biológicos; são eles que nos estimulam e impulsionam a dedicar nossas vidas para a ciência. The most beautiful experience we can have is the mysterious - the fundamental emotion which stands at the cradle of true art and true science. Albert Einstein V SUMÁRIO AGRADECIMENTOS... IV RESUMO GERAL INTRODUÇÃO GERAL Sistema Imunológico: Visão Geral Imunidade Natural Imunidade Adquirida Linfócitos Desenvolvimento do Sistema Imune Medula Óssea e Hematopoiese Timo e Diferenciação dos linfócitos T Funcionamento do Sistema Imune Ativação dos linfócitos B e T Zebrafish (Danio rerio): Modelo Experimental Sistema Imunológico em Peixes Teleósteos Hematopoiese e Desenvolvimento Hormônio do Crescimento (GH) e seu Receptor (GHR) Via de Sinalização do GH Interações do GH sobre o Sistema Imunológico Aquicultura e Geração de Organismos Transgênicos para o GH Efeitos do GH sobre o Sistema Imune em Peixes Transgênicos OBJETIVO GERAL Objetivos Específicos ARTIGO: Effects of somatotrophic axis (GH/GHR) double transgenesis on structural and molecular aspects of zebrafish immune system Highlights: Abstract: Introduction Materials and Methods Transgenic fish lineages, crossings and maintenance conditions Histological and morphometric analysis Immunohistochemical analysis Analysis of gene expression Statistical Analyses Results Histological and morphometric analysis Analysis immunohistochemical Gene expression analysis VI 4. Discussion Annexes Table 1. Gene- specific primers used for quantitative PCR expression analyses Figure 1. Histological analysis Figure 2. Thymus immunohistochemistry Figure 3. Head kidney immunohistochemistry Figure 4. Gene expression analysis References CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFIA GERAL VII RESUMO GERAL O desenvolvimento de organismos transgênicos para o hormônio do crescimento (GH) tem sido considerado uma importante alternativa para o aumento nas taxas de crescimento animal. Entretanto, os efeitos do excesso do GH não se limitam aos processos do crescimento. Sistemas fisiológicos como o sistema imunológico, já demonstraram ser prejudicados pelo desbalanço dos níveis do GH. Tendo em vista a importância da geração de organismos transgênicos para o GH no âmbito da aquicultura, esforços se fazem necessários na elaboração de estratégias com o intuito de reduzir ou compensar os efeitos adicionais do excesso de GH. Nos hipotetizamos que a geração de peixes duplo transgênicos os quais superexpressem GH e GHR apenas no músculo esquelético, poderia ser uma possível alternativa para compensar os efeitos prejudiciais ocasionados pelo excesso de GH sobre os sistemas fisiológicos mantendo, ao mesmo tempo, as altas taxas de crescimento. Afim de testar esta hipótese, nós avaliamos a morfometria de órgãos imunes, como o timo, o rim cefálico e o baço; os conteúdos de células T CD3 + e CD4 + no timo e no rim anterior e a expressão de genes relacionados à imunidade. Contrariando as expectativas iniciais, os resultados revelaram que a superexpressão do GHR no músculo esquelético não é capaz de diminuir os efeitos danosos causados pelo GH no tamanho do timo e rim anterior e no conteúdo de células T CD3 + e CD4 + nestes órgãos. Inesperadamente, zebrafish transgênicos somente para o GHR revelaram prejuízos nos aspectos imunes similares aos observados aos transgênicos para GH. De forma geral, estes resultados indicam que a dupla transgenia para o GH/GHR não é capaz de atenuar os efeitos negativos causados pelo excess de GH sobre o sistema imunológico de zebrafish transgênicos. Além disso, a transgenia para genes componentes do eixo somatotrófico pode ainda reforçar os danos as funções imunes em transgênicos, não recuperando os danos causados pelo excesso de GH. 8 1. INTRODUÇÃO GERAL 1.1 Sistema Imunológico: Visão Geral Qualquer pessoa que tenha tido o privilégio de ouvir o desempenho de uma brilhante orquestra executando uma sinfonia [...] sabe que cada instrumento musical cuidadosamente afinado contribui para o som coletivamente harmonioso produzido pelos músicos. De certo modo, o sistema imunológico, trabalhando de forma harmoniosa, atua continuadamente como uma orquestra sinfônica para manter a homeostasia no contexto das defesas do hospedeiro (Coico e Sunshine, 2010). A palavra imunidade é oriunda do termo em latim immunis no qual significa isento. Dessa forma, esse termo se refere aos mecanismos utilizados pelo corpo como proteção contra agentes ambientais que são estranhos, tornando o corpo isento a eles. Assim sendo, para garantir a imunidade, os seres vivos contam com um sistema complexo formado por órgãos, células e moléculas que se comunicam entre si e exercem ações coordenadas para defesa do organismo; tal sistema foi denominado como sistema imunológico. A sofisticada capacidade de reconhecimento que o sistema imunológico possui, o permite distinguir moléculas que são próprias do organismo daquelas que não são próprias e ainda permite o desencadeamento de respostas imunológicas. De maneira conceitual, o sistema imunológico de vertebrados é dividido em imunidade natural e imunidade adquirida. Entretanto, apesar de suas diferentes características, esses sistemas funcionam de maneira integrada nos mecanismos de resposta imunológica contra patógenos (Sunshine and Coico, 2010) Imunidade Natural A imunidade natural ou inata representa a primeira barreira de defesa frente à presença de patógenos, conferindo ao organismo um padrão de resposta não específico contra invasores externos. Apesar disso, muitas infecções são controladas por este aparato sem a necessidade de recorrer ao sistema imune adaptativo (Levraud and Boudinot, 2009). Esse padrão de imunidade é composto por barreiras físicas e químicas inespecíficas, e também por componentes celulares. Dentre as barreiras físicas que compõem esse sistema estão a pele e as membranas mucosas; e compondo as barreiras químicas fatores como o ph, ácidos graxos e proteínas séricas como a enzima lisozima. Esses componentes participam da primeira linha de defesa do organismo. Entretanto, caso patógenos ultrapassem estas defesas externas ao corpo, a imunidade inata ainda conta com componentes 9 celulares capazes de desencadear respostas para combater o patógeno. As células fagocíticas como os granulócitos e os macrófagos, as células dendríticas e as células natural killer, são ativadas após entrarem em contato com microorganismos, podendo liberar potentes antimicrobianos e citocinas. Essas células também estão envolvidas em etapas importantes no desencadeamento de respostas imunológicas adquiridas que são mediadas por linfócitos B e T, assim como em processos inflamatórios. Um exemplo desse envolvimento é o processo de apresentação de antígeno as células T da imunidade adquirida. Células apresentadoras de antígenos (APCs) da imunidade natural apresentam epítopos antigênicos para às células T, o que possibilita que essas desenvolvam e apresentem respostas antígeno- específicas. Os epítopos antigênicos são apresentados para às células T ligados ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC), um complexo protéico expresso na superfície celular das APCs (Sunshine and Coico, 2010) Imunidade Adquirida Diferentemente da imunidade inata, a imunidade adquirida apresenta padrões de resposta específicos diante a determinado antígeno. Evolutivamente, esse tipo especializado de defesa surgiu somente a partir dos vertebrados sendo que invertebrados são providos somente de respostas imunes inatas (Du Pasquier, 2001). Os linfócitos T e B são as principais células componentes desse sistema e conferem a capacidade de memória ao sistema imune, impedindo assim uma reinfecção com o mesmo microrganismo. Respostas imunológicas derivadas desse sistema, frequentemente, necessitam mais tempo para se desenvolver tendo em vista que, mediante ao microrganismo, os poucos linfócitos T e B específicos para determinado antígeno precisam sofrer expansão clonal para que possam ajudar a combater a infecção. Nos mamíferos a medula óssea, o timo, o baço e os linfonodos são os principais órgãos envolvidos na maturação, na diferenciação, na proliferação e nas respostas desencadeadas pelos linfócitos (Sunshine and Coico, 2010) Linfócitos Os linfócitos B e T, participam das respostas imunes adaptativas em vertebrados. Apesar desses linfócitos apresentarem peculiaridades em relação ao local de maturação (células T maturam no ambiente tímico), acredita- se que os linfócitos derivem de células progenitoras comuns de linfócitos, common lymphoid progenitors (CLP), durante a hematopoiese (Kondo et al., 1997). Ambos, linfócitos B 10 e T, expressam receptores específicos em suas membranas celulares. Os linfócitos B expressam imunoglobulinas, que podem inclusive ser secretadas e atuar como fatores humorais, enquanto os linfócitos T expressam um complexo conhecido como receptor de célula T (TCR). Toda a capacidade de reconhecimento e especialização que os linfócitos possuem se deve ao fato de que estas células são capazes de expressar receptores antígeno- específicos de sequência única, ou seja, cada linfócito é capaz de expressar um receptor único para o reconhecimento de um tipo antigênico. Essa característica possibilitou um imenso repertório de antígenos capazes de ser reconhecidos por essas células. Estima- se que o número de células B e T, com diferentes especificidades antigênicas que podem ser geradas em um único indivíduo, varie de a 10 18, o que significa que um indivíduo possa gerar de a diferentes moléculas de Ig ou TCR. Essas especificações apenas se tornaram possíveis devido a um sistema coordenado de rearranjo gênico, no qual participam proteínas como recombination activating gene - 1 (RAG- 1) e RAG- 2. Esses processos de recombinação serão discutidos em mais detalhe no tópico sobre os processos relacionados aos linfócitos T. Linfócitos T Em mamíferos, percursores de linfócitos T são originados a partir de células- tronco hematopoiéticas (HSCs) na medula óssea. Tardiamente, estes progenitores são endereçados para o timo onde sofrem processos de maturação e diferenciação, antes de serem liberados para a corrente sanguínea. Uma vez na corrente sanguínea essas células migram para órgãos imunes periféricos como o baço e linfonodos, para completar sua diferenciação (Boehm and Bleul, 2006). Esses linfócitos apresentam uma especificidade restrita para antígenos. Eles são capazes de reconhecer peptídeos antigênicos ligados a proteínas do hospedeiro pertencentes ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) que se expressam nas superfícies das células apresentadoras de antígenos (APC) (Maisey and Imarai, 2011). Dessa forma os linfócitos T reconhecem e respondem a antígenos ligados a superfície celular e não a antígenos solúveis. 11 Complexo TCR A resposta contra antígenos desencadeada pelos linfócitos T acontece por intermédio da expressão do complexo TCR na membrana destes linfócitos. Este complexo é composto pelo receptor antígeno- específico das células T (TCR), juntamente com moléculas co- receptoras transmembrânicas. O TCR é formado por duas cadeias polipeptídicas, α e β ligadas por pontes de dissulfeto. Cada uma dessas cadeias apresenta domínios extracelulares similares aos encontrados nas moléculas de imunoglobulinas, com regiões constantes (C) e variáveis (V), que se dobram e são estabilizados por pontes de dissulfeto. As cadeias α e β são glicoproteínas transmembrânicas que possuem ainda uma região amino- terminal variável e uma região terminal com grupos carboxilas constante (Saito et al., 1984). Associado ao TCR ainda estão duas moléculas importantes envolvidas na transdução de sinal: o receptor CD3 e o receptor ζ (zeta) também conhecido como CD247. CD3 está sempre associado ao TCR e é invariante em todo repertório de células T, sendo formado por três peptídeos de pesos moleculares distintos γ, δ, e ε. Por sua vez, CD247 é formado por duas cadeias ζ idênticas. Esses dois receptores, CD3 e CD247, não participam na ligação com o antígeno. Entretanto, essas moléculas participam em importantes etapas nas fases iniciais de ativação das células T. Os receptores TCR, CD3 e CD247 formam o que chamamos de complexo TCR (Fig.1). Fig. 1 Esquema da apresentação antigênica realizada pelas células apresentadoras de antígenos (APC) às células T. Em detalhe, as principais moléculas expressas na membrana celular da célula T (Batista, CR., Trabalho de Conclusão de Curso). 12 Ainda, na superfície dos linfócitos T maduros são expressas moléculas correceptoras que não se ligam ao antígeno, mas aumentam a capacidade de ativação das células T diante os antígenos. Esses correceptores podem ser CD4 ou CD8, dividindo assim a população de células T em dois subtipos principais: linfócitos T CD4 + ou T CD8 +. Essas moléculas são capazes de se ligar, seletivamente, a porções extracelulares invariáveis das moléculas do MHC do hospedeiro, sendo que CD4 tem a capacidade de se ligar ao MHC classe II enquanto CD8 tem a afinidade pelo MHC classe I. Essa ligação ajuda a fortalecer a interação entre as células T e APC. Sendo assim, CD4 e CD8 funcionam como moléculas de adesão. Essa ligação induz a transdução de sinal intracelular devido a porção interna desses receptores estar ligada a enzimas quinases. O CD4 é expresso como um monômero na superfície das células T, enquanto que o CD8 é expresso como um heterodímero constituído de duas cadeias CD8α e CD8β. Os linfócitos CD4 + estão principalmente envolvidos na defesa do organismo contra agentes extracelulares que foram ingeridos pelos macrófagos bem como na produção de citocinas, enquanto os linfócitos CD8 + estão mais
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